Fluorospark? Kinase/ADP Multi-Assay Kit是和光(wako)与日本东京大学新药研究机构共同研发的ADP荧光检测试剂盒。拥有高通量筛选（HTS）必备的高灵敏度、高准确度、低成本、简便等特性。本产品不仅可检测激酶，同时可用于检测产生ADP的酶（如ATP酶、乙酰基—CoA羧化酶）的活性。咨询订购热线：400-021-8158
激酶分析筛选试剂盒
Fluorospark? 激酶/ADP多重检测试剂盒(货号291-77401)
Fluorospark? Kinase/ADP Multi-Assay Kit
Fluorospark? 激酶/ADP多重检测试剂盒
简单快捷，高灵敏度定量检测ADP。用红色荧光“Resorufin”定量经激酶反应生成的ADP，可实时检测。
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激酶抑制剂的筛选
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激酶活性测定
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ADP产生酶活性分析
试剂盒原理
本试剂盒通过酶偶联反应，简单、高灵敏度地定量检测ADP。经激酶反应生成的ADP，可用红色荧光物质试卤灵定量。
Fluorospark? 激酶/ADP多重检测试剂盒检测原理
优点/特点
● 适合终点(endpoint)和实时实验
● 优异的Z'-factor数据（数据差异小）
● 高灵敏度检测ADP量
● 检测直到ADP 30 μmol/L仍可保持线性关系
● 一步反应，检测时间短（~30分钟）
● 成本较低
与传统发光法比较
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试剂名称 |
Fluorospark? Kinase |
传统发光法（A公司） |
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原理 |
ADP定量（荧光） |
ADP定量（发光） |
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操作顺序 |
1步 |
2步 |
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所需时间 |
30分钟 |
70~100分钟 |
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ADP定量范围 |
~30 μmol/L |
~1 mmol/L |
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价格 |
低成本 |
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试剂盒组成
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No. 试剂 |
用途 |
1,000次 |
10,000次 |
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底物液 |
2×制备检测液 |
9 mL |
90 mL |
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酶液 |
500 μL |
5 mL |
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刃天青液 |
100 μL |
1 mL |
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还原封闭剂 |
400 μL |
4 mL |
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D 终止液 |
停止偶联反应 |
10 mL |
100 mL |
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10 mmol/L ATP溶液 |
激酶反应，制作标准曲线 |
100 μL |
1 mL |
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10 mmol/L ADP溶液 |
制作标准曲线 |
100 μL |
1 mL |
案列应用
【实验流程（终点（endpoint）法）】
激酶反应液里添加等量的2×检测液（使用时制备）即可检测激酶活性
【制作ADP标准曲线】
用0、10、20、30 μmol/L ADP制作标准曲线。
良好的线性关系可定量最多至30 μmol/L的ADP。
【低浓度ADP区域里定量】
制作各ATP/ADP浓度（ATP+ADP=1,10,100 μmol/L）里底物变换率0-10%标准曲线
ATP/ADP标准曲线里底物变换率低（=ADP浓度低）时线性关系依然较好
【荧光信号的稳定性】
20 μmol/L ADP和2x检测液混合，在30分钟~7小时候检测荧光强度。30分钟后的荧光强度标准化为100%，相关变动表格如下。
ADP和2×检测液混合后，在30分~7小时内的荧光信号十分稳定。
【数据：Z'-factor实测值】
定量与各ATP/ADP浓度（ATP+ADP=1,10,100 μmol/L），5%底物变换率相当的ADP时，本试剂盒方法与传统发光法的Z'-factor比较。
Z'-factor：Fluorospark? Kinase >传统发光法（A公司）
在各ATP浓度里，5%低底物变换率也有优异的Z'-factor。
【什么是Z'-facotr】
Z'-facotr是一个关于信号区间和变异的组合，它已成为评估测试方法质量的主要参数。使用Z'-factor=1-(3×SDH+3×SDL)/(AvH-AvL)公式计算（SDH和SDL为阳性对照和阴性对照的方差，AVH和AVL为阳性对照和阴性对照的平均值）。
| Z-factor | Interpretation |
| 1.0 | 理想情况下等于1.0。Z factor永远不可能超过1.0。 |
| 0.5-1.0之间 | 较好的实验。 |
| 0-0.5之间 | 临界的实验（较差的实验）。 |
| 小于0 | 阳性对照和阴性对照的数值有很多重叠。 |
【制作抑制曲线】
制作cAMP-依赖性蛋白激酶(PKA)抑制剂H-89的抑制曲线 （PKA 0.02U/μL，ATP 5μmol/L，Kemptide 125μg/mL及各浓度的H-89）
Fluorospark? Kinase与传统发光法（A公司）有几乎相同的IC50值。
（本方法得到的H-89 IC50值与文献值*（IC50=40nmol/L）几乎相同）
* Hidaka, H. et al., Methods Enzymol., 201, 328-39(1991).
【实验流程（实时法）】
通过实时检测荧光强度，实时检测激酶活性。
【ADP定量反应时间的比较（实时检测）】
对各浓度ADP［ADP=0, 0.25, 0.5, 1, 2μmol/L（ATP+ADP=10 μmol/L）］进行实时检测。
Fluorospark? Kinase在约十分钟内完成ADP定量反应。背景（ADP=0 μmol/L）信号稳定。
【实时检测添加DTT的影响】
ADP=2 μmol/L（ATP+ADP=10 μmol/L）里添加还原剂DTT（0.1、1 mmol/L），进行实时检测。
Fluorospark? Kinase在约十分钟内完成ADP定量反应。即使DTT浓度增高，结果依然稳定。
【通过实时检测计算PKA的Km（ATP）值】
在各种ATP浓度下通过实时检测计算出PKA反应速度，并求取ATP的PKA（Km值）
根据实时检测进行酶的动力学分析。
本方法得到的Km值与文献值**（3~15 μmol/L）几乎相同）
** Flockhart, D.A. and Corbin, J.D., CRC Crit. Rev. Biochem., 12, 133-86(1982).
产品列表
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产品编号 |
产品名称 |
规格 |
级别 |
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291-77401 |
Fluorospark? Kinase/ADP Multi-Assay Kit Fluorospark? 激酶/ADP 多重检测试剂盒
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1000次 |
for Enzyme Activity Assay |
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