FITC标记葡聚糖
CAS Number: 60842-46-8
FITC标记葡聚糖是由荧光素异硫氰酸酯(5-异构体)与相应的葡聚糖偶联合成的。控制每个批次的分子量，取代度，干燥失重和游离FITC。TdB生产分子量4kDa到20kDa的FITC标记葡聚糖。FITC标记葡聚糖是黄色至橙色粉末，易溶于水或盐溶液，呈黄色溶液。该产品也可以溶于DMSO, 甲酰胺和其它极性有机溶剂，但在低级脂肪醇，丙酮，氯仿和DMF中基本不溶。
结构
葡聚糖是来源于肠系膜白串珠菌B-512F的分支多糖，本质上是一种α-(1-6)链接的线性葡萄糖链。分支比例大约是5%。荧光素是通过稳定的硫代氨甲酰键链接的，标记过程不会引起任何葡聚糖的解聚。FITC标记葡聚糖，每个葡萄糖单元对应0.002到0.008 mol的FITC。 这些低取代度使葡聚糖电荷极小，这也是渗透性研究最基本的要求。
图1 FITC标记葡聚糖分子结构示意图
光谱数据
FITC标记葡聚糖的荧光最佳激发波长为493nm，最佳检测波长为518nm（图2）。由于荧光素的电荷依赖于溶媒的pH和离子强度，荧光强度也随着这些参数而变化。在pH>8时观测到最大强度。在生物媒介中测量，会明显影响荧光强度，增强或衰减。
图2 FITC标记葡聚糖70在pH9.0磷酸盐缓冲生理盐水中的荧光图谱
图3 FITC标记葡聚糖在pH4-9的荧光（发射波长520nm）
储存和稳定性
FITC标记葡聚糖在密封容器室温下可以保存6年以上。
已经在多种介质和不同温度条件下调研过FITC标记葡聚糖的稳定性。研究表明，FITC标记葡聚糖无论在体内或体外都很稳定。仅当pH>9和温升时，存在荧光标记水解的风险。37℃下对兔血浆、肌肉匀浆、肝匀浆和尿液的研究证实，FITC标记葡聚糖至少可稳定3天。分子量没有变化，荧光素亦未见释放。FITC标记葡聚糖在6%三氯乙酸溶液中在室温下可稳定3天。pH10-10.75时氢氧根离子对水解反应存在特异性催化作用(1)。
通过HPLC检测，硫代氨甲酰键的水解引起4-或5-氨基荧光素的增加。 一项未发表的研究考察了跨度5个月的时间里在压力容器中，温度范围8到50°C下的 FITC标记葡聚糖 70溶液。仅在50°C下观测到游离氨基荧光素略微增加了1%。 仅高压只释放了2.7%的游离氨基荧光素。另一项未发表的研究表明，FITC标记葡聚糖溶液在pH 4温度高至35°C下一个月内稳定。即使80°C和pH 4时, 硫代氨甲酰键可稳定30分钟。不过，葡聚糖可能会降解。pH 9时，1个月时间内, 相当客观的荧光标记多糖(24 %)减少了。多项研究表明在实验持续时间内FITC标记葡聚糖在体内的稳定性(2)。
毒性
小鼠实验表明, FITC标记葡聚糖静脉或腹腔注射量高达 6g/kg体重时，耐受性仍良好。 毒性模式与母体葡聚糖的一致。葡聚糖作为血浆扩容剂在临床上已经用了50多年。人体在注射了临床用的葡聚糖溶液后，观察到葡聚糖诱导的类过敏反应 (DIARs)的发生(3,4)。 FITC标记葡聚糖亦可能显示类似的行为模式，但相关实验动物出现问题极少见诸报道。
合成
来源于天然的葡聚糖B512F经荧光素标记制备了对应的荧光标记葡聚糖。荧光素是通过稳定的硫代氨甲酰键链接的，标记过程不会引起任何葡聚糖的解聚。FITC标记葡聚糖，每个葡萄糖单元对应0.002到0.008 mol的FITC。 这些低取代度使葡聚糖电荷极小，这也是渗透性研究最基本的要求。分子量超过5000 Daltons的葡聚糖分子在溶液中呈有弹性的延长的卷状。下表1显示了不同分子量的分子空间尺寸。
葡聚糖和FITC标记葡聚具有牛顿流体特征，例如粘度与剪切速率无关（图4）。在pH4-10范围的研究显示，粘度与pH无关。 在pH8-9和6.5-9.5下，经电泳，FITC标记葡聚糖的等电点未发生迁移(1)。
Fig. 4. 不同浓度下葡聚糖的粘度
产品列表
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产品编号 |
品名 |
分子量(kDa) |
包装 |
| FD4-100mg |
FITC标记葡聚糖4 |
4 |
100 mg |
| FD4-1g |
1 g |
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| FD4-5g |
5 g |
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| FD10-100mg |
FITC标记葡聚糖10 |
10 |
100 mg |
| FD10-1g |
1 g |
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| FD10-5g |
5 g |
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| FD20-100mg |
FITC标记葡聚糖20 |
20 |
100 mg |
| FD20-1g |
1 g |
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| FD20-5g |
5 g |
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| FD40-100mg |
FITC标记葡聚糖40 |
40 |
100 mg |
| FD40-1g |
1 g |
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| FD40-5g |
5 g |
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| FD70-100mg |
FITC标记葡聚糖70 |
70 |
100 mg |
| FD70-1g |
1 g |
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| FD70-5g |
5 g |
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| FD110-100mg |
FITC标记葡聚糖110 |
110 |
100 mg |
| FD110-1g |
1 g |
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| FD110-5g |
5 g |
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| FD150-100mg |
FITC标记葡聚糖150 |
150 |
100 mg |
| FD150-1g |
1 g |
||
| FD150-5g |
5 g |
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| FD500-100mg |
FITC标记葡聚糖500 |
500 |
100 mg |
| FD500-1g |
1 g |
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| FD500-5g |
5 g |
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| FD2000-100mg |
FITC标记葡聚糖2000 |
2000 |
100 mg |
| FD2000-1g |
1 g |
||
| FD2000-5g |
5 g |
应用
FITC标记葡聚糖主要用于渗透性和微循环研究。也可用作分子量标志，用于给药研究及
其它
FITC标记葡聚糖主要用于细胞和组织中渗透性和传递研究。测定荧光可提供健康组织和病态组织渗透性的定量数据。可以通过活体荧光显微镜实时进行。该技术灵敏度极高，组织液体中浓度低至1μg/ml亦可检测出。 FITC标记葡聚糖在细胞中亦可作为一种pH探针使用(6,7)。 极化实验也表明，荧光素结合葡聚糖仍保留了较高的旋转自由度，激发态下的荧光寿命和未结合的相近(6)。
-
常规过程
在不同的实验条件下，仓鼠颊囊的微血管是研究血浆渗漏的有效模型，例如缺血/再灌注后，或局部应用一系列炎症介质、寄生虫和细菌。利用该技术，可以实时研究血管渗透性变化，并与白细胞粘附、活化等微血管事件相关联。使用合适的滤光片（490/520nm）对颊囊进行活体荧光显微镜检查，并用数码相机拍摄图像。注射5%FITC标记葡聚糖150生理盐水溶液，（约100毫克/千克体重）(8-10)。
通过荧光结合立体显微镜对渗透性的研究，Thorball（2）报道了荧光光学显微镜。本文还包括FITC标记葡聚糖参与的组织固定技术和显微镜设置（滤镜、照明）的细节。用再生钛耳室（兔子）进行FITC标记葡聚糖参与的血液/淋巴微循环系统研究。植入后4-8周可见淋巴生长（11）。
图5. 注射FITC标记葡聚糖 150后拍摄的颊囊图像。第二张图显示的是服用组胺后微血管的渗漏
(图片版权E. Svensj?)
2.肠道组织的渗透性研究
使用FITC标记葡聚糖 150 (12)研究处于炎症期的肠上层单皮的渗透性。使用FITC标记葡聚糖4（13）研究蛋白酶抑制剂对胃肠道粘膜糜烂和上皮功能障碍的作用。Thorball做了大量使用FITC标记葡聚糖在胃肠道进行组织固定的研究(2)。FITC标记葡聚糖 (4000-70000)用于皮肤热损伤在体外使用改进型尤斯灌流室后引起的渗透性变化(14)。请参看参考资料(15,16)。
3. 大脑和神经系统的渗透性研究
有关神经系统中FITC标记葡聚糖的研究，需要示踪剂固定技术，使神经元、胶质细胞、坐骨神经内脊膜、神经节等特征具有良好的光学分辨率。采用干燥解剖组织样品冷冻、80℃甲醛蒸汽固定，石蜡或塑料包埋的方法证明效果良好（17）。在安装和检测之前，这些切片要浸入二甲苯中。
给仓鼠和小鼠静脉注射了FITC标记葡聚糖（Mw 3000到150000），研究在体内的分布。正常的大脑皮层神经周围扩散屏障，均不被上述分子量范围内任何FITC标记葡聚糖渗透（19）。仓鼠的注射量为0.5ml生理盐水，含浓度为5mg /10g体重的FITC记葡聚糖（18）。调查了FITC标记葡聚糖对海马体渗透性的影响。聚焦超声用于血脑屏障检查，分析FITC标谱聚糖的渗透情况（19）。
采用静脉注射FITC标记葡聚糖150（20）检测缺血再灌注损伤后，与时间相关的脑血管渗透性。通过FITC标记葡聚糖监测蛋白相关渗透性变化，进行急性肝功能衰竭后脑水肿的研究（21）。
4. 肿瘤组织的渗透性研究
5. 眼窝内的渗透性研究
6.肾组织渗透性研究
70%剂量的FITC标记葡聚糖4在第一个小时内快速分泌至尿液(兔子、老鼠)(未发表数据)。Lencer和同事(31)研究报道了FITC标记葡聚糖10作为探针探测肾脏内肾小球的功能和定位。对切除组织的冷冻切片进行了荧光显微镜检查。
多种应用
FITC标记葡聚糖曾用于体外鼻粘膜的渗透性研究 (32)。该项研究还涉及带电荷的 FITC标记葡聚糖衍生物。 使用载有溶解微针的FITC标记葡聚糖20用于药物在皮肤的直接扩散研究(33)。