各品牌都将脂质、核酸或细胞膜的荧光标记试剂加以改造，使之成为包括外泌体在内的细胞外囊泡的特异荧光标记试剂。该标记方法是让从各个样品中分离、提取出来的外泌体样品与荧光色素进行反应，通过凝胶过滤或超滤装置去除未反应的荧光色素。在该荧光标记的过程中，特别是去除未反应的荧光标记时，会因吸附而损失大量的外泌体样品，同时，通过向外泌体样品添加FUJIFILM Wako开发的EV-Save™ Extracellular Vesicle Blocking Reagent（下面简称EV-Save），能强烈抑制吸附损失（图1）。用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS从COLO201细胞培养上清中分离、提取外泌体样品，先用A公司的荧光标记试剂进行标记，然后用B公司的凝胶过滤柱去除未反应色素。将获得的荧光标记外泌体样品加入HeLa细胞培养上清中，经过24小时的细胞吸收后，用荧光显微镜及流式细胞仪检测。在荧光色素标记时预先向样品中加入EV-Save，结果显示，细胞内的荧光信号比未添加EV-Save时大幅增强（图1、A, B）。用PS Capture™ Exosome ELISA Kit后再比较凝胶过滤前后外泌体样品的吸附损失， 未添加EV-Save的样品在凝胶过滤后没被检测到外泌体表面标记物CD63的信号，而添加了EV-Save的样品则检测到了CD63的信号，所以，EV-Save能有效抑制凝胶过滤引起的吸附损失（图1、C）。
图1．荧光标记外泌体样品的吸收确认与EV-Save抑制吸附损失的效果
用A公司的荧光标记试剂对MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS分离的COLO201来源外泌体样品（1×1010particles）进行标记后，再用荧光显微镜（A）和流式细胞仪（B）确认HeLa细胞吸收外泌体样品的情况。
准备同上的外泌体样品（5×109particles），可以用PS Capture™ Exosome ELISA Kit比较CD63信号来检测凝胶过滤前后的损失（C）。
图2．使用了各种荧光标记试剂的外泌体标记与外泌体被HeLa细胞吸收的确认
用各种荧光标记试剂对MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS分离的COLO201 来源外泌体样品（1× 1010 particles）进行标记，再用荧光显微镜（A）和流式细胞仪（B）确认HeLa细胞对外泌体样品的吸收情况。另外，作为对照，还准备了同样进行过荧光标记处理的试剂盒附带的Elution buffer和1%BSA 溶液，然后添加到细胞中（B）。
图3．比较PS亲和提取与超离提取外泌体的吸收的效率
用A公司的荧光标记试剂对用MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS和超离法分离的COLO201来源的外泌体样品（8×109particles）进行标记，然后在荧光显微镜下比较HeLa细胞吸收外泌体的效率（A）。各提取法配制的外泌体样品，以BCA assay 检测蛋白浓度，使用NanoSight的NTA检测粒子数，同时，通过PS亲和ELISA法检测CD63的信号（B）。
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产品编号
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产品名称
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规格
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包装
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058-09261
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EV-Save™ Extracellular Vesicle Blocking Reagent
EV-Save™ 细胞外囊泡吸附抑制剂 |
研究用
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1mL
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在进行外泌体的荧光标记法和细胞吸收外泌体的确认时应该注意的两点是，外泌体具有的吸附特性与收量低下密切相关，现在市面上销售的荧光标记试剂不是以外泌体染色为目的而开发的，对外泌体的特异性较低。对于如何配制高纯度的外泌体样品，本文提出了分离、提取方法的重要性。但是至今为止，如多数论文报告主要采用的那样，分离、提取含有外泌体的细胞外囊泡的方法的黄金标准仍然是超离法，但实际上，超离法配制出的外泌体样品会混入很多非细胞外囊泡来源的杂质蛋白，我们仍在继续彻底评估污染物对下游实验结果的影响。International Society for Extracellular Vesicles的杂志《Journal of Extracellular Vesicles》也提到过这个问题4）。以FUJIFILM Wako开发的"PS亲和法"为基础的MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS还有待改善，但它比超离法和各种分离、提取试剂盒能相比，能更简便地提取高浓度的外泌体。衷心希望在未来FUJIFILM Wako的产品能有助于以外泌体为代表的细胞外囊泡研究的进一步发展。
2） Nakai, W. et al . : Sci. Rep ., 6, 33935（2016）.
3） Saito, S. et al . : Sci. Rep ., 8, 3997（2018）.
4） Gardiner C. et al . : J. Extracell. Vesicles , 5, 32945（2016）
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