西宝生物科技(上海)股份有限公司

• 什么是内毒素？
• 关于内毒素的检测方法？
• 内毒素检测用具的要求？

【内毒素标准品】

根据检测目的使用适当类型的内毒素标准品。

•需符合BET（美国药典/ 欧洲药典 / 日本药典）的检测，例如药品和医疗器械的产品最终检验

→必须使用美国药典，欧洲药典或日本药典标准的内毒素国家标准品。

•对材料，工艺流程和其他相关主题的检测

→可以使用内毒素工作标准品（CSE）。

【样本干扰】

有时候需要采取预防措施，以防止样本对内毒素检测有潜在影响（反应干扰）。这些干扰分为以下两种类型：

（1）对LAL试剂的干扰

>•蛋白变性剂（例如酸，碱，尿素，表面活性剂，有机溶剂）

•蛋白酶和蛋白酶抑制剂

•螯合剂（会清除反应所需的钙和镁）

•对于比色法：着色物质（在约405 nm处具有相当大吸收的物质）

•对于比浊法：浊度

（2）对内毒素的干扰

•金属离子（例如铁，铝，镓和铬离子。即使微摩尔级别的存在也会对测试产生影响）

•表面活性剂

样本的干扰效果可以通过进行药典中的干扰因子测试来衡量：即通过对加标了已知量的内毒素的样本进行检测，获得加标内毒素的回收率。如果回收率在50％至200％范围内，则可以确定该样本不会造成影响，换句话说，检测所得的内毒素浓度是正确的。如果发现样本会造成影响，可以通过对样本溶液进行稀释，从而减少对测试的影响。然而，对样本溶液的稀释会提高了由原始溶液（预稀释溶液）的浓度转换而得的内毒素浓度值。合理的稀释倍数（最大有效稀释倍数），是根据待检测的内毒素的所需浓度以及所用LAL试剂的检测灵敏度来确定的。欲了解反应干扰因子和最大有效稀释度的详细信息，详见药典中的细菌内毒素检测。

【Limulus ES的原理（内毒素特异性试剂）】

LAL试剂和内毒素的级联反应机制如图4所示。如果反应体系中存在（1→3）-β-D-葡聚糖*，会激活G因子，引起伴有凝胶化的假阳性反应。在这种情况下，无论体系中是否存在内毒素，都会发生反应，意味着无法对内毒素进行特异性检测。为此，我们研发出Wako's Limulus ES，该产品通过在反应体系中加入过量共存的（1→3）-β-D-葡聚糖（羧甲基化凝胶多糖），从而来抑制（1→3）-β-D-葡聚糖的干扰。因此，β-葡聚糖对LAL试剂的活化受到抑制，从而使内毒素特异性检测能够进行。过量的β-葡聚糖可以抑制其自身反应的原理如图5所示：β-葡聚糖和LAL试剂之间反应的浓度范围对于整个反应而言很窄。另一方面，内毒素和鲎试剂的反应在很宽的浓度范围内都会发生，并且不受大量共存的β-葡聚糖的任何干扰。Wako的LimulusES就是根据这个原理而制作的（见图6）。

*（1→3）-β-D-葡聚糖来源于霉菌（真菌）或经纤维素滤膜过滤所得。

图5. 羧甲基化凝胶多糖和LAL反应

使用Toxinometer®（检测时间设定为99 min）和Limulus HS进行检测。

○：在99 min内检测不到凝胶的生成

●：有凝胶的生成

图6. 羧甲基化凝胶多糖对使用Limulus HS和Limulus ES进行的内毒素检测的影响

A：Limulus HS

B：Limulus ES

○：内毒素的系列稀释

▲：含有1 μg/mL羧甲基化凝胶多糖的内毒素系列稀释

【内毒素产品列表】