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磷酸化和去磷酸化是细胞中酶的化学修饰调节中最常见，也是最重要的。很多酶需要磷酸化后才有活性，然后再进一步使它的下游磷酸化。Cisbio Bioassays 提供一系列HTRF磷酸化蛋白测量试剂，可以直接检测细胞裂解液或完整细胞中的磷酸化蛋白的含量。该方法操作简单、稳定可靠、灵敏度高，并且可以用很小体积的微孔板进行实验，非常适合高通量筛选。HTRF 技术可用来进行第二信使检测、胞内信号分子检测和受体配体结合检测方案，从而从全方位帮助您进行G蛋白偶联受体的研究。

西宝生物提供的HTRF技术磷酸化检测试剂盒和相关激酶，品种齐全，质量保证。订购热线：400-021-8158！

HTRF磷酸化检测原理：

实验可在细胞裂解液或者完整细胞中进行。当受体被刺激后，引发了相关激酶的活化，导致下游蛋白被磷酸化。细胞膜裂解之后，磷酸化的蛋白释放出来，被HTRF试剂检测到。磷酸化蛋白的测量应用了双抗体夹心法，两个抗体均为单克隆抗体。其中一个为抗磷酸化蛋白的抗体，标记Eu；另一个为抗蛋白其它位点的抗体，标记d2，见图1。这些抗体可以预先混合后，通过一次加样来完成。所有的实验均可通过两步法或者一步法实现。

图1：HTRF磷酸化蛋白测量的实验过程

一步法：

细胞铺板，化合物刺激，细胞裂解和磷酸化蛋白检测均在同一个板孔中，不需要洗涤过程。此方法更加适用于高通量筛选，并且在不影响HTRF优越性的前提下减少了试剂用量。

两步法：

细胞置于培养板中，化合物刺激后裂解细胞。将裂解液转移到检测板中，加入HTRF检测试剂检测磷酸化蛋白该方法可以观察细胞的存活和生长情况。

目前已经上市的HTRF磷酸化检测试剂盒有：

下面我们重点来看一下这款pERK磷酸化检测试剂盒

Cellul´erk 胞外调节蛋白激酶磷酸化检测试剂盒 --- 直接测量细胞水平实验中磷酸化ERK1/2的含量

ERK1/2是许多信号传导通路的会聚点，所以可以用磷酸化ERK含量的变化来反应G蛋白偶联受体是否被活化或者抑制。 磷酸化ERK1/2检测是基于双抗体夹心法的原理。在试剂盒中含有两个抗体，一个抗体是抗磷酸化ERK1/2的抗体，标记d2；另一个抗体是抗ERK1/2其它位点的抗体，标记Eu。

受体受到刺激，ERK1/2被磷酸化。在细胞膜裂解之后，磷酸化的ERK1/2释放出来，通过基于HTRF技术的双抗体夹心法被检测到。其中 试剂盒应用HTRF技术，不需要洗涤，比Western Blot、 ELISA和其它基于微珠测试的方法更加简单快速。

磷酸化检测原理图

Rantes 和 MIP-Ib在室温条件下刺激CCR5受体（CHO，25,000细胞/孔），时间为10分钟，用HTRF Cellul´ERK 试剂盒来测试磷酸化ERK1/2水平。EC50分别为2.8 nM和18.8 nM，与文献报道一致。

CHO-CCR5中ERK1/2的磷酸化水平

用Carbachol （卡巴胆碱）在室温刺激CHO-M1细胞，时间为10分钟（5,000细胞/孔，384浅孔板），结果如下图

选择未刺激的细胞、1.3 μM Carbochol和4 μM Carbochol计算Z´值，分别对应实验的基础水平、EC80和EC100，每种条件50个重复，实验采用一步法。两个条件的Z´值均大于0.7，表明实验非常稳定，可用于高通量筛选。

用PMA刺激CHO-M1细胞（50,000细胞/孔），时间为10分钟，结果如图 PMA是PKC的直接激活剂。该实验得到的EC50为9.6 nM，检测窗口为4.5。

PMA刺激的CHO-M1细胞中ERK1/2的磷酸化水平

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